新晋院士申有青团队，最新Nature！

通过局部给药实现蛋白质和肽类等生物大分子的经皮递送，具有便捷、患者依从性高、可避免变性以及首过效应小等优势。然而，由于皮肤独特的结构形成了难以穿透的屏障，这种递送方式一直被认为不可行。皮肤结构包括疏水的角质层（SC），它是一个厚度为10～15微米的基质，其中嵌有脱水死亡的角质细胞，并被高度有序的脂质层所包围；此外，活性表皮层和真皮层中还存在紧密连接。目前，皮下注射胰岛素仍是治疗1型糖尿病和晚期2型糖尿病的标准方法，但这种方法会伴随疼痛、恐针症、皮肤并发症以及患者依从性差等问题。尽管人们已对非侵入性胰岛素给药方式进行了广泛探索，但至今仍未取得成功。

为提高生物大分子的皮肤渗透性，人们已探索了多种策略，包括使用化学渗透促进剂使角质层脂质双分子层流动化，利用电气装置强制渗透，采用超声波和射流注射在皮肤表面创建瞬时通道，以及使用微针刺穿角质层进入真皮组织。然而，这些侵入性技术会破坏皮肤完整性，引发不便、感染和安全性方面的担忧。或许存在一种可透皮材料需先在皮肤表面富集，然后高效扩散通过角质层中疏水的角质细胞间脂质基质，进而进入亲水性的活性表皮层。人们已对阳离子肽进行了经皮递送测试，这类肽可通过静电作用与皮脂和角质层中带负电荷的烷基羧酸结合，且已有报道称部分阳离子肽具有皮肤渗透性。然而，这种皮肤渗透并非通过角质细胞间脂质基质扩散实现，因为强结合作用会使它们固定在角质层中而无法扩散，而是通过附属器途径实现，因此在人体中效率低下，因为附属器区域仅占人体皮肤面积的不到0.1%。

近日，浙江智能生物材料重点实验室与生物纳米工程中心的申有青院士团队报道了一种能够在皮肤角质层表面结合时呈聚阳离子状态，而在更深层角质层中转变为两性离子以实现自由扩散的聚合物[2-（N-氧化-N,N-二甲基氨基）乙基甲基丙烯酸酯]（OP），将具有皮肤渗透性。OP在酸性条件下被质子化而带正电荷，因此会在含有脂肪酸的酸性皮脂和角质细胞间角质层脂质中富集，随后通过角质细胞间脂质层扩散。在角质层下方，处于正常生理pH值环境下时，OP转变为中性两性离子，从而能够高效迁移通过表皮层和真皮层，最终进入真皮淋巴管和全身血液循环。因此，与OP偶联的胰岛素能够高效透过皮肤进入血液循环；对1型糖尿病小鼠经皮给予剂量为116单位/千克的OP偶联胰岛素，可迅速将其血糖水平降至正常范围；而对糖尿病小型猪经皮给予29单位/千克的剂量，则可使其血糖水平恢复正常。因此，这种可透皮的聚合物有望实现胰岛素的非侵入性经皮递送，使糖尿病患者免受皮下注射之苦，并有可能通过经皮递送方式促进其他蛋白质和肽类治疗药物的便捷使用。

OP的皮肤渗透性：

通过活性自由基聚合反应，将OP的分子量控制在约4.5千道尔顿（kDa），并引入末端胺基以便用荧光染料标记聚合物链，得到OPCy5。首先通过将OPCy5局部涂抹于雄性C57BL/6J小鼠背部皮肤，评估了OP的皮肤渗透性。使用共聚焦成像结果显示，涂抹OPCy5四小时后，在小鼠皮肤各层均观察到Cy5荧光。相比之下，对照聚乙二醇偶联Cy5（PEGCy5）仅停留在皮肤表面。通过将连接在OP链上的5纳米金纳米颗粒（OP–AuNPs）涂抹于小鼠背部皮肤并进行高分辨率成像，进一步验证了OP对角质层的穿透性。局部涂抹的OPCy5可在0.5小时内经皮进入血液，并在涂抹后约2小时达到最大浓度。在血液循环中，OP主要在肝脏中蓄积，其次是肾脏和肺。鉴于猪皮在结构、厚度、毛发稀疏程度以及胶原蛋白和脂质组成方面与人类皮肤极为相似，进一步利用猪皮同样证明了OPCy5的经皮渗透能力。

图 OP的皮肤渗透性

OP–I的皮肤渗透性：

通过评估经皮递送的OP偶联胰岛素（OP–I）的降血糖效果，来衡量OP的皮肤渗透性。利用重组人胰岛素（赖氨酸残基胺上带有叠氮基团）与末端带有二苯并环辛炔（DBCO）基团的OP（分子量为4.5千道尔顿）之间的应变促进炔-叠氮环加成反应，将胰岛素与OP进行偶联。利用SPR技术，在固定有胰岛素受体细胞外结构域（ECD-IR）或胰岛素样生长因子1受体细胞外结构域（ECD-IGF1R）的传感器芯片上，测定了胰岛素和OP–I的受体结合动力学。结果显示，二者的解离常数（Kd）无显著差异（OP–I为26.06纳摩尔，胰岛素为14.03纳摩尔）。OP–I和胰岛素与固定化的ECD-IR的结合速率常数（kon）、解离速率常数（koff）和半衰期（t1/2）也相当，表明二者具有相似的结合动力学特性。与胰岛素类似，OP–I与IGF1R细胞外结构域的结合也极少。这些结果共同表明，OP偶联并未改变胰岛素对其受体的亲和力和特异性。

全原子分子动力学模拟显示，OP–I能稳定吸附于其受体的两个主要结合位点。平均力势分析估算出OP–I与受体位点1和位点2的结合能分别为-14.0和-22.9千卡/摩尔，与胰岛素的结合能（-16.7和-22.0千卡/摩尔）相当。模拟结果证实，OP偶联保留了胰岛素与ECD-IR的结合亲和力。综上所述，这些发现表明OP–I保留了胰岛素受体的结合亲和力，并能激活下游信号通路，从而发挥其降血糖作用。

首先，利用模拟重建人体表皮的三维（3D）皮肤等效模型EpiKutis，通过共聚焦观察了偶联物随时间变化的皮肤渗透情况。结果显示，OP–IFITC的荧光在30分钟内即扩散至整个表皮层，而PEG–IFITC和游离的insulinFITC仅在EpiKutis表面产生微弱荧光。测得OP–I在EpiKutis中的稳态通量（Jss）为0.50±0.12微克/平方厘米/小时，显著高于PEG–I（0.10±0.01微克/平方厘米/小时）和胰岛素（0.05±0.01微克/平方厘米/小时）。OP–I的渗透系数（Kp）分别是PEG–I和胰岛素的4.50倍和9.17倍。

利用活体双光子显微镜对C57BL/6J小鼠皮肤内层进行连续的z轴堆叠成像显示，局部涂抹OP–IFITC后，其可深入渗透至皮肤组织，甚至抵达皮下组织。相比之下，PEG–IFITC和游离胰的insulinFITC在皮肤内仅呈现稀疏且分散的荧光。OP–I的皮肤渗透速度快且呈时间依赖性。局部涂抹OP–ICy5于小鼠背部皮肤10分钟后，用BODIPY标记的皮下脂肪组织中即可观察到显著的Cy5荧光，且随时间推移荧光积累量进一步增加。OP–IFITC可定位于小鼠皮肤的各个区域，包括表皮（角质层和活性表皮）、真皮、毛囊和皮下组织。在淋巴毛细血管周围或内部可观察到大量OP–ICy5，这表明OP–I可进入有渗漏的淋巴毛细血管，随后进入血液循环，这与皮下注射大分子通过淋巴摄取进入全身循环的报道相一致。此外，局部涂抹OP–ICy5 4小时后，可有效渗透小型猪皮肤，进一步证明了其经皮递送能力。

图 OP–I的皮肤渗透性

OP–I的降血糖效力：

局部应用OP–I后，小鼠血浆胰岛素浓度迅速上升，在治疗1小时后达到约230微单位/毫升的峰值，随后在12小时后逐渐降至约30微单位/毫升。值得注意的是，尽管局部应用OP–I在最初2小时内与皮下注射胰岛素的血浆浓度变化趋势相当，但此后其血浆水平持续高出1.6至6倍。此外，重复局部应用OP–I得到的血浆胰岛素浓度变化趋势非常相似，表明其具有高度可重复性和可靠性。局部应用的OP–ICy5可在肝脏、脂肪组织和骨骼肌等关键血糖调节组织中蓄积。这些组织的细胞可摄取OP–ICy5，并有效激活胰岛素受体信号通路，表现为受体及其下游蛋白AKT的磷酸化水平，与皮下注射天然胰岛素诱导的磷酸化水平相当。因此，OP–I在这些组织中发挥胰岛素的功能，包括增强葡萄糖摄取、促进糖原合成和抑制糖异生。

采用链脲佐菌素（STZ）诱导的1型糖尿病小鼠，评估局部应用OP–I调节血糖水平的能力。使用扩散池将OP–I、PEG–I或天然胰岛素溶液局部应用于随机分组的糖尿病小鼠背部皮肤，以皮下注射胰岛素作为阳性对照。皮下注射胰岛素可在1小时内迅速将血糖水平（BGLs）从约400毫克/分升降至100毫克/分升，随后在4小时内反弹至高血糖水平（约400毫克/分升）。局部应用胰岛素和PEG–I对血糖水平影响甚微。相比之下，局部应用OP–I表现出高效、剂量依赖性的降血糖作用。剂量为116单位/千克时，OP–I可在1小时内迅速将血糖水平降至200毫克/分升以下，效果与皮下注射胰岛素相当，但能维持正常血糖水平（50 - 200毫克/分升）达12小时。较低剂量的局部应用OP–I（58或29单位/千克）降低血糖水平速度较慢，但仍能有效将血糖水平恢复至正常范围，凸显了针对个体患者进行剂量优化的潜力。值得注意的是，移除扩散池后，OP–ICy5可在8小时内从皮肤中清除。重要的是，局部应用部位不会影响OP–I的经皮递送效率或降血糖活性。

腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTTs）进一步证实了局部应用OP–I的血糖调节能力。先对糖尿病小鼠进行1小时的局部OP–I治疗，然后腹腔注射葡萄糖溶液（每千克体重1.5克）。小鼠血糖水平在葡萄糖给药后30分钟内达到峰值（330毫克/分升），随后在1小时内逐渐降至约100毫克/分升，此后维持正常血糖水平。作为参考，接受相同葡萄糖给药的健康小鼠表现出类似的血糖变化趋势，但即使在2小时后，其血糖水平仍高于200毫克/分升。局部应用胰岛素或PEG–I的糖尿病小鼠在腹腔葡萄糖给药后，血糖水平升至约600毫克/分升，并维持高血糖状态。0至2小时的曲线下面积（AUC）表明，与其他治疗方法相比，经皮OP–I能更好地调节血糖水平。

将OP–I、PEG–I或天然胰岛素掺入水包油乳膏中，涂抹于STZ诱导的糖尿病小型猪腹部皮肤，评估其体内降血糖效果。OP–I乳膏可在2小时内将血糖水平降至正常范围，6小时时达到最低值（100毫克/分升），并维持正常血糖水平达12小时。OP–I在小型猪中的降血糖作用也呈剂量依赖性；较低剂量可产生类似的降血糖趋势，但调节血糖水平的效率降低。同样，局部应用PEG–I或胰岛素治疗几乎未引起小型猪血糖水平的明显变化。这些结果表明，局部应用OP–I可有效在糖尿病小鼠和小型猪中发挥降血糖作用，凸显了其作为皮下注射胰岛素非侵入性替代方案的潜力。

图 局部OP–I在STZ诱导糖尿病小鼠和迷你猪中的降血糖效力

SC穿透机制：

接下来，研究了OP–I穿透皮肤角质层（SC）的机制。在局部应用OP–ICy5 4小时后，从小鼠皮肤上剥离外层角质层；使用NBD-C6-HPC对角质层脂质进行染色。共聚焦显示，Cy5荧光（红色）与NBD-C6-HPC染色（绿色）显著重叠，表明OP–I定位于角质细胞周围的角质层脂质中。活体双光子显微镜进一步证实了角质细胞周围存在OP–IFITC。在小型猪皮肤中也观察到类似结果，其较厚的角质层便于观察，显示OP–ICy5与角质细胞周围的角质层脂质重合。这些发现表明，OP–I在角质细胞间脂质基质中蓄积并扩散，有效穿透角质层。此外，FTIR光谱研究显示，OP或OP–I均未增强角质层内的脂质流动性。

采用分子动力学模拟研究OP–I与SC脂质的相互作用；模型SC脂质由神经酰胺、胆固醇和脂肪酸的等摩尔混合物组成。在弱酸性条件（pH 5.5）下，OP和OP–I吸附到SC脂质上的速度均快于胰岛素。势能面分析估计，OP与SC脂质的结合自由能为-8.5千卡/摩尔，OP–I为-11.7千卡/摩尔，胰岛素为-6.0千卡/摩尔，这表明在酸性pH条件下，OP和OP–I与脂质膜的结合更强。沿SC脂质表面（x方向）进行的PMF分析估计，OP的扩散能垒为0.9 ± 0.1千卡/摩尔，OP–I为1.7 ± 0.2千卡/摩尔，胰岛素为2.2 ± 0.3千卡/摩尔。因此，根据斯托克斯-爱因斯坦关系推导出的摩擦系数（γ）为：OP为2.07 × 10^-10牛秒/米，OP–I为4.31 × 10^-10牛秒/米，胰岛素为8.49 × 10^-10牛秒/米。OP和OP–I与SC脂质的摩擦系数较低，表明它们受SC脂质的“局部捕获”作用较小，扩散速度比胰岛素快。分子动力学模拟还比较了OP–I在弱酸性（pH 5.5）和中性（pH 7.0）条件下与SC脂质的相互作用。在pH 7.0时，OP转变为两性离子状态，大大降低了其与SC脂质的静电相互作用，使OP和OP–I能够自由扩散。值得注意的是，在pH 5.3~7.4时，胰岛素带负电荷，而OP带轻微正电荷。MD模拟表明，在pH 6.0时，由于胰岛素的电荷密度较低且OP的亲水性较强，胰岛素和OP不会结合形成聚集体。

因此，一旦将OP或OP–I涂抹在皮肤上，皮肤表面的酸性环境会使OP质子化，使OP和OP–I都能与SC脂质结合并在SC层中富集。上层SC下方酸度降低会解除这种结合，使OP和OP–I能够通过角质细胞间脂质扩散，并深入渗透到活表皮层。

图 OP和OP–I的SC穿透机制

OP–I从SC进入皮肤活表皮层后，通过跨细胞转运途径或细胞间隙进行转运。使用人永生化角质形成细胞系（HaCat）的三维培养球体对此过程进行了研究。用OP–IFITC处理12小时的球体表现出强烈的荧光，而用PEG–IFITC或insulinFITC孵育的球体仅表现出微弱荧光。用内吞作用或外排作用抑制剂预处理并未抑制OP–IFITC在HaCat球体中的渗透。值得注意的是，即使孵育24小时后，OP–ICy5仍仅定位于细胞膜上，细胞质中未检测到荧光。同样，对局部涂抹OP–ICy5的猪皮切片进行共聚焦成像显示，OP–ICy5主要分布在细胞膜上，而非细胞内。

采用全内反射荧光显微镜，利用用膜标记物（NBD-C6-HPC）标记的细胞（绿色）与OP–ICy3共培养，研究了OP–I在细胞膜上的运动模式。细胞膜上红色荧光点的主动运动表明，OP–ICy5在相邻细胞间跳跃。通过将预先用OP–ICy5处理过的HaCat细胞（供体细胞）与稳定表达绿色荧光蛋白的新鲜HaCat细胞（HaCatGFP，受体细胞）混合，进行了直接观察OP–ICy5细胞间传递的实验。共聚焦成像和流式细胞术分析显示，HaCatGFP细胞逐渐从供体细胞获得Cy5荧光。延长供体细胞和受体细胞的接触时间或增加两种细胞群体的密度，均可提高传递效率。将盖玻片1（经OP–ICy5处理的HaCat细胞）与盖玻片2（未经处理的HaCat细胞）面对面接触，也促进了OP–ICy5的传递。这些观察结果共同证实了OP–I的细胞接触依赖性传递。因此，OP–I在表皮或真皮中的转运不涉及细胞内过程，而是通过膜介导的扩散进行的细胞间过程。

图 OP–I在活性表皮中穿透的机制

小结

皮肤特有的酸性至中性pH梯度与OP与SC脂质的pH依赖性结合之间的协同作用，是OP和OP–I快速渗透皮肤的基础。在pH > 7时，OP呈两性离子状态，但随着pH降低，OP逐渐质子化而带正电荷。在皮肤酸性表面（pH约5），带正电的OP与SC和角质细胞间脂质（含约15%的脂肪酸）强烈结合，从而在SC和角质细胞间脂质中富集。随着pH逐渐升高至深层SC层的约7，OP转变为中性状态，失去对SC脂质的亲和力，并通过角质细胞旁空间自由扩散进入活表皮层。在活表皮层和真皮层，OP和OP–I不进入细胞，而是在细胞膜上跳跃，这避免了细胞内降解，并促进了高效的皮肤渗透。真皮中的OP和OP–I随后被排入通透性淋巴毛细管，随后进入体循环，与其他大分子类似。

OP–I的高效皮肤渗透实现了足够的血浆胰岛素递送，并在关键的血糖调节组织（特别是肝脏、脂肪和肌肉）中积累，在糖尿病小鼠和迷你猪中产生了即时、强效且持久的降血糖效果，以及与皮下注射胰岛素相当甚至更优的腹腔葡萄糖耐量试验（IPGTT）结果。OP和OP–I的皮肤渗透完全无创且无刺激性。反复局部应用不会引起SC微观结构发生结构变化、角质细胞脱落、细胞间隙变宽，也不会引起炎症或细胞死亡迹象。因此，OP作为一种有前景的非侵入性经皮胰岛素递送系统，为糖尿病管理提供了皮下注射的理想替代方案。

总之，作者团队研究提出了一种非侵入性经皮胰岛素递送系统，该系统通过OP的高效皮肤渗透，实现了与皮下注射相当的体内降血糖疗效，可用于糖尿病治疗。OP偶联技术可用于肽、蛋白质和核酸等生物大分子的经皮递送，具有广泛的治疗应用前景，值得在未来的研究中进一步探索。

参考文献：

Qiuyu Wei, Zhi He, Zifan Li, et al. A skin-permeable polymer for non-invasive transdermal insulin delivery. Nature. 2025 Nov 19.

https://www.nature.com/articles/s41586-025-09729-x