瓣花因其层层叠叠、饱满华丽的花型和稀缺性，历来是花卉育种的重要目标。特别是“花中生花”型重瓣花，其中心不断生长出新的花器官，具有更强的层次感和视觉冲击力，在园艺市场尤为稀缺。根据经典的ABC花器官发育模型，C类AGAMOUS（AG）基因特异调控雄蕊与心皮的形成，同时调控花分生组织的终止发育过程（floral determinacy）。当AG基因完全功能缺失时，雄蕊将转化为花瓣，心皮转化为新的小花，从而形成“花中生花”型的重瓣花。然而，由于大多数植物中存在两个功能冗余的AG类同源基因，导致通过自然突变或诱变手段获得功能完全丧失的材料极为困难。此外，由于重瓣花中雄蕊和心皮发育异常，也难以通过杂交手段将该性状转移到其他
品种。
近日，上海师范大学生命科学学院张辉团队在国际著名期刊Plant Biotechnology Journal（IF 10.5）上发表了题为“Efficient creation of decorative double-flowered petunia through CRISPR/Cas9-mediated simultaneous editing of PMADS3 and FBP6 genes”的研究论文。该工作通过CRISPR/Cas9多位点编辑技术，精准敲除了矮牵牛中两个功能冗余的AG同源基因——PMADS3和FBP6，不仅让雄蕊转变成花瓣，还打破了花分生组织的程序性终止，在雌蕊位置长出新的花器官，最终创制出具有典型“花中生花”结构的重瓣矮牵牛，展现出极高的观赏性。为了同时高效编辑PMADS3与FBP6基因，本研究在传统双子叶基因编辑载体基础上，引入了再生因子GRF4-GIF1元件，并在GRF4的miR396结合序列引入6个同义突变用于进一步增强表达，从而构成出增强型双子叶基因编辑载体eDGE1 (enhanced dicot genome editing 1)。利用tRNA系统将两个分别靶向PMADS3与FBP6的sgRNA同时克隆至eDGE1载体，并将其转化入实验室常用品种W115（Mitchell）中。结果显示，在W115中，FBP6的编辑效率达100%，其中纯合或双等位突变率为43.75%，杂合/嵌合突变率为56.25%；PMADS3的编辑效率为37.50%。获得的编辑株系#4（PMADS3基因型为WT/+1 bp，FBP6基因型为-1 bp/-4 bp）和#12（PMADS3基因型为WT/+1 bp，FBP6基因型为-1 bp/-1 bp）的花药均发生了明显的瓣化，并伴随柱头结构异常。这表明，FBP6的单基因突变可使雄蕊瓣化，形成典型的重瓣花。图1.靶向编辑PMADS3与FBP6基因在矮牵牛W115中形成弱重瓣花表型进一步将该载体转化商业化品种Mirage Rose，共获得 120 株阳性植株。基因型检测显示，PMADS3的编辑效率为 55.83%，其中 10.00% 为纯合或双等位突变体；FBP6 的编辑效率为 85.00%，其中 74.17% 为纯合或双等位突变体，两个基因同时发生纯合/双等位突变的效率为 3.33%。在株系 #40（PMADS3基因型为WT/+1 bp，FBP6基因型为-2 bp/-2 bp）、#46 （PMADS3基因型为+1/+1 bp，FBP6基因型为-6 bp/-6 bp）和 #105（PMADS3基因型为+1/-1 bp，FBP6基因型为-1 bp/-3 bp）中，植株形态与野生型无显著差异，但均表现出明显的雄蕊瓣化现象。其中， #105 的瓣化花瓣最大，#40 最小；三者心皮均不同程度地转化为新的花器官，尤其#105在花中央形成了一个结构清晰、花型饱满的“新花”，展现出典型的“花中生花”重瓣表型，具有极高的观赏价值。qRT-PCR分析进一步证实了基因编辑效果：与野生型相比，PMADS3在#40、#46和#105中的表达量分别下降了约79.14%、97.66%和98.02%；FBP6的表达量分别下降了97.00%、96.55%和89.51%。图2.在Mirage Rose中同时靶向编辑PMADS3与FBP6创制丰富的重瓣花由于重瓣化导致正常结实能力受限，该研究通过扦插方式对编辑植株的性状稳定性进行验证。结果显示，所有通过营养繁殖获得的新植株均完整保留了母体的重瓣特征，未出现性状分离或退化现象，表明该重瓣性状可通过无性繁殖方式稳定传代，图3.基因编辑重瓣矮牵牛通过扦插繁殖保持性状稳定性为进一步探究重瓣性状的分子基础，研究人员对#105及其野生型对照在不同花器官中基因表达进行了RNA-seq分析。结果显示，与前述 qRT-PCR 分析结果一致，FBP6和PMADS3基因在雄蕊/心皮组织中高表达，而在瓣化组织（包括雄蕊转变成的花瓣及雌蕊位置新的小花）中，这两基因的表达水平显著下降，分别为野生型的 6.43%（FBP6）和 3.83%（PMADS3）。A类基因（FBP29、AP2 和FBP26）在野生型花瓣中表达活跃，其中AP2表达量最高，但在雄蕊和心皮中的表达极低或几乎不可检测。在#105中，A类基因在花瓣中的表达水平与野生型相近，而在瓣状器官中均表现出显著上调，提示其参与瓣化结构的形成。对于B类基因（TM6、GLO1、GLO2和DEF），除TM6外，其余基因（DEF、GLO1和GLO2）在野生型中于花瓣及雄蕊/心皮中均有表达，花瓣中表达水平略高。而在#105中，它们在瓣状器官中的表达显著升高，接近或达到花瓣水平，支持其在雄蕊瓣化过程中的作用。值得注意的是，TM6在野生型中主要在雄蕊/心皮中表达，在花瓣中表达较弱，而在#105中其在瓣状器官中的表达显著下降，接近花瓣表达水平，进一步支持其表达变化与器官命运转化相关。图4.野生型与基因编辑重瓣矮牵牛中 ABC 类花器官发育基因的转录表达分析进一步通过加权基因共表达网络分析（Weighted correlation network analysis，WGCNA），研究者发现FBP6与PMADS3具有最高的共表达相关性，表明它们在花器官发育中的紧密协同作用。此外，WGCNA还鉴定出多个与PMADS3和FBP6高度共表达的 MADS-box 家族转录因子成员，包括B类基因TM6，以及此前未在重瓣调控中报道的AGL19 和 MADS9，提示它们可能参与调控花决定性及瓣化过程，为后续创制重瓣花品种提供了新的潜在分子靶点。本研究不仅突破了“花中生花”型重瓣矮牵牛育种的技术瓶颈，也展示了基因编辑技术在花卉种质创新中的巨大应用潜力，为我国花卉种质创新提供了新思路和关键技术支撑。上海师范大学硕士生薛迎双、副教授汪冲和硕士生葛容为论文共同第一作者，研究生路双、段雨声、洪政以及本科生倪静参与了该工作，张辉教授为通讯作者。本研究得到了上海市农业科技创新计划（2024-02-08-00-12-F00007，K2023002）及崇明区农业科技创新项目（2021CNKC-02-02）资助。张辉团队长期致力于植物基因编辑工具的开发及应用，在水稻和多种花卉（如百合、矮牵牛、香豌豆等）中建立了高效基因编辑体系，为我国花卉种质创新提供了强有力的技术支撑。
2025-07-16
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